1.核酸提取

1.1什么是核酸

核酸分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），其中RNA又可以根据功能的不同分为核糖体RNA(rRNA)，信使RNA（mRNA）和转移RNA（tRNA）。

1.2核酸提取纯化原则和要求

保证核酸一级结构完整型； 排除其他分子的污染；

1.3.常见的核酸提取方法

a、溶液型抽提溶液型抽提是比较经典的提取方法，几乎都含有去污剂（如 SDS ）和盐(如Tris、EDTA、NaCl 等)。盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境，还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏（如 EDTA ）、维持核酸结构的稳定（如 NaCl ）等。去污剂则是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。这种方法虽然成本较低，但较为繁琐，提取的核酸质量也较为一般。

b、柱式抽提

柱式抽提是用于微量核酸分离纯化的较为简单的方法，其基本原理是利用裂解液促使细胞破碎，使细胞中的核酸释放出来。 把释放出的核酸特异地吸附在特定的硅载体上，这种载体只对核酸有较强的亲和力和吸附力，对其他生化成分如蛋白质、多糖、脂类则基本不吸附，因而在离心时被甩出柱子。再把吸附在特异载体上的核酸用洗脱液洗脱下来，分离得到纯化的核酸。

其成本较低，但提取质量较好，是目前市场的主流提取方法。

c、磁珠法提取

磁珠纯化法与硅胶膜离心柱的原理基本相同，运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。利用氧化硅纳米微球的超顺磁性，在 Chaotropic 盐（盐酸胍、异硫氰酸胍等）和外加磁场的作用下，能从血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中的 DNA 和 RNA 分离出来。

文库构建

1.1DNA文库构建

DNA文库构件上构建是二代测序技术的基础，DNA文库构建的本质就是将待测定样本的大片段基因组DNA片段化为小片段的DNA，之后在小片段的DNA分子两端添加测序接头，形成能上机测序的有效地文库分子的过程。DNA文库构建流程主要包括：DNA片段化、末端修复、A尾添加、接头连接、PCR富集五个步骤。

1.2RNA文库构建 二代测序RNA文库的构建，根据RNA的种类主要分为mRNA文库、lncRNA文库、small RNA文库等。mRNA和lncRNA文库构建流程包括：RNA富集、RNA片段化、cDNA第一链合成、二链合成、PCR富集。RNA富集是mRNA及lncRNA文库构建的必要步骤，这是因为rRNA在总RNA中的占比超过80%，如不进行rRNA取出操作，mRNA及lncRNA文库的测序数据中绝大部分为rRNA的相关数据，不利于全面深入分析mRNA及lncRNA的表达差异及序列变化。Small RNA文库构建与mRNA和lncRNA文库的构建流程略有差异，主要包括：3’接头连接及封闭、5’接头连接、cDNA合成、PCR富集。

2.cfRNA

面对癌症，“上工治未病”显得尤其重要，有效的早期诊断对癌症治疗有极大帮助：经由早期诊断的患者，五年生存率要比晚期患者高 5-10倍。因此尽早发现癌症可以给患者提供最好的治愈机会。目前，即使全世界范围内，早期诊断技术还没有成熟，一个易于普及、 高特异高敏感的检测方法是癌症早期诊断和筛查的瓶颈所在。 液体活检技术是人们期望很大的一类癌症早期检测技术，其标志物包括了循环肿瘤细胞（CTC）、细胞外DNA（cfDNA）及其甲基化、细胞外 RNA(cfRNA)、外泌体蛋白等。与CTC/cfDNA相比，cfRNA作为癌症标志物至少有以下3个优势： 1.敏感性和功能性： RNA可以通过细胞外排机制，如外泌体，更主动地进入细胞之外的环境中, 因此，基于cfRNA的生物标志物不仅在癌症早期就有很多信号出现在病人血浆中，而且可以提供更多的功能学信息。 2.组织特异性： 很多RNA（包括人源和微生物源）的表达是有组织特异性的，因此，不同肿瘤中特异RNA表达谱的改变可以反映在血浆中。 3.低成本： 针对癌症信号的有效的cfRNA 测序相对于cfDNA及其甲基化测序成本更低，对早筛早诊的普及更有利。 2022年7月11日，生命学院鲁志团队与北京大学第一医院王鹏远团队、南昌大学徐振江团队等多家单位的医疗和科研人员合作，在生物医学权威期刊eLife上发表题为“利用血浆中人和微生物来源的无细胞RNA进行癌症类型分类”（Cancer type classification using plasma cell-free RNAs derived from human and microbes）的研究论文，报导了细胞外RNA（cfRNA）在泛癌早期诊断中的应用和前景。

  Fig.1 研究方法和路线

研究发现：利用人类血浆中小 RNA（small RNA）之外的更长更微量的cfRNA（包括了mRNA, lncRNA, circRNA 等），通过生物信息学分析和机器学习模型的整合，可以很好地诊断常见五大癌症（结肠癌、胃癌、肝癌、食道癌、肺癌），AUC（曲线下面积）达到0.91（尤其是肝癌可以达到0.95以上）。值得一提的是，本研究特别强调针对早期癌症的研究（65%以上的病例属于早期肿瘤），即使在所有早期病例队列里，诊断AUC仍可以达到0.9，揭示了cfRNA 在癌症早期诊断中的价值。另外，在人源cfRNA基础上，如果结合微生物来源的cfRNA，还可以更加准确地区分癌症组织类型。

         Fig.2 cfRNA可以用于癌症诊断