RNA是存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体，不同类型RNA具有不同的作用。转移RNA（tRNA）在蛋白质翻译中起着重要作用。如果tRNA中发生错误修饰或修饰缺失，会产生错误或不完整的蛋白质。

 

已有研究发现，多种tRNA修饰酶的突变与各种人类疾病有关，包括神经退行性疾病、代谢疾病和癌症。但是，研究tRNA一直面临着诸多挑战，部分原因是缺乏一种同时量化其丰度和化学修饰的简单方法。因为目前的纳米孔测序设置会丢弃绝大多数tRNA reads，测序产量低，并且基于转录物长度对tRNA丰度的表示有偏差。 

 

 近日，来自西班牙巴塞罗那科学技术研究所的研究团队及合作者在Nature Biotechnology发表了题为“Quantitative analysis of tRNA abundance and modifications by nanopore RNA sequencing”的研究论文。研究团队开发了一种名为Nano-tRNAseq的tRNA纳米孔测序新方法，可直接对天然tRNA进行精确测序，准确定量tRNA丰度并同时捕获tRNA修饰变化。研究团队利用Nano-tRNAseq成功检测了酿酒酵母tRNA群同一分子内不同tRNA修饰类型之间的串扰和相互依赖性，以及tRNA群体对氧化应激的反应变化。

图1.文章发表在Nature Biotechnology

牛津纳米孔技术公司（ONT）开发的直接RNA测序（DRS）平台是基于NGS技术来描述tRNA组的一个很有潜力的替代方案。该技术允许对天然RNA分子进行直接测序，因此，原则上可以检测和定量tRNA修饰和tRNA丰度，不需要逆转录或PCR。先前的研究已经证明，纳米孔可以使用固态或生物（ONT）纳米孔捕获tRNA。通过连接接头来延长tRNA分子，tRNA可以通过生物纳米孔进行测序、基础标记和定位。但上述方法tRNA分子的测序产量较低，并且没有报告是否使用该方法再现了现存的体内tRNA丰度和/或tRNA修饰。

 

研究团队发现，对原始纳米孔信号强度再处理，用RNA接头填充5′和3′tRNA末端，可以准确地进行碱基判定和映射，并捕获整个tRNA序列，使tRNA reads的数量增加12倍，并获得准确的tRNA丰度。这种基于纳米孔的方法被命名为Nano-tRNAseq（图1），可用于对天然tRNA进行测序，并在单个实验中获取到tRNA丰度和修饰动力学的定量估计。研究团队表示，在体外和天然tRNA分子测序、碱基判定和映射方面，Nano-tRNAseq方法是使用纳米孔进行DRS最成功的方法。

图2.Nano-tRNAseq可以有效地对天然tRNA进行测序

天然tRNA具有短而高度修饰的特性，这使它们的比对具有挑战性。对DRS数据集中修改碱基的不准确判定也使原tRNA检测含有很大比例的不匹配碱基。由于这些错误的碱基，使用推荐设置的常用长读长映射工具minimup2（-ax-map ont-k15）仅可以比对一小部分reads（2.56%）。为了提高Nano-tRNAseq reads可映射性，研究团队测试了短reads映射算法BWA，发现使用推荐参数的BWA-MEM比对在映射readas的比例方面优于minimup2。

 

当使用参数为-W13 -k6 -xont2d -T20的BWA-MEM时，发现增加的映射reads和错误比对之间存在最佳平衡，映射了54.63%的reads，错误比对很少（0.19%）。当在天然tRNA分子中比较两个映射算法的性能时，对比更加明显。随后，研究人员评估了Nano-tRNAseq reads的可映射性是否受5'和3' RNA接头长度的影响。研究发现，即使参考序列中没有RNA接头，短的和未修饰的序列也可以有效地比对，而短的和修饰的reads则从带有接头的延伸序列中受益匪浅，表明带有RNA接头的延伸序列分子对于指导富含“错配”短reads的正确比对至关重要，例如来自天然tRNA的短reads。

       在生命的宏伟交响乐中，small RNA无疑是其中不可或缺的一部分。small RNA是指长度在200nt以内的非编码RNA，包括miRNA、siRNA 、 piRNA、snRNA等。small RNA广泛存在于生物体内，是一类重要的功能分子。它们微小而精致，却在细胞内部发挥着至关重要的作用，调控着基因的表达，参与着各种生命活动。

       研究发现，small RNA在肿瘤的病理过程中起着重要作用，能够诱导靶基因表达的不稳定性，抑制肿瘤细胞的增殖和转移。而在神经系统中，small RNA也发挥着关键的调控作用，影响着神经细胞的生长、分化和功能。随着技术的不断进步，我们对small RNA的认识也在不断深化。 高通量测序技术具有检测完全且准确度高，可重复性好，通量高等优点，在探索研究small RNA上具有巨大优势。当然想要开展高通量测序实验，必然缺少不了样本提取与建库的流程。

      今天，就让我们一起踏上small RNA提取与建库的神奇之旅，并深入探索这些微小分子的生物学功能。首先，我们聊聊small RNA的提取。这一过程就如同从生命的海洋中筛选出那闪耀的珍珠，科学家们凭借精密的实验设计和专业的试剂，小心翼翼地从复杂的细胞环境中提取出这些珍贵的small RNA分子。

        新辉自主研发的血浆/血清small RNA提取试剂盒，其裂解液能高效破坏样本中有细胞膜结构的成分，并使蛋白变性释放核酸，同时使用具有专利结构的硅磁聚体（SMAGG）吸附small RNA，并利用SMAGG可逆磁响应的物理性质富集和清洗非特异性结合的杂质和盐，使用洗脱液将纯化后的small RNA从磁性微球中分离，得到满足下游检测需求的small RNA。

       接下来，是关键的建库环节。建库，就像是为这些small RNA搭建一个家园，让它们能够有序地生活在一起。科学家们运用高通量测序技术，将提取到的small RNA进行扩增和标记，构建出一个包含大量small RNA信息的文库。这个文库就像是一本生命的百科全书，记录着small RNA的种类、数量和功能。

        新辉生物建库试剂盒采用独有的接头自连产物去除专利技术，实现了对微量small RNA样本的文库构建，同时选择使用一管式反应流程进一步减少了文库构建起始模板的投入量。

        新辉生物开发的small RNA建库试剂盒适用于起始量为500pg~20ng不同样本来源的small RNA样本，经过接头连接、逆转录、二链合成和PCR扩增，经过文库构建最终转化为适用于Illumina及MGI平台测序的文库，根据实验测试，新辉试剂盒文库产量及miRNA检出种类数远高于国内外竞品，同时也验证了试剂批间性能稳定 在这场small RNA提取与建库的奇妙之旅中，我们不仅能够领略到生命科学的魅力，更能够感受到科学的力量。通过研究small RNA，我们能够更深入地研究这些微小分子的功能，揭示它们与生命活动的关联，为未来的医学研究和治疗策略提供新的思路和方向。让我们期待这场旅程能够继续深入，为人类揭开更多生命的奥秘，为人类的健康和福祉带来更多的突破和惊喜！

      杭州新辉生物技术有限公司成立于2022年4月，是一家核酸研究的上游试剂及仪器平台供应商，位于中国浙江自由贸易试验区。新辉生物专注于纳米材料和生物芯片类产品的开发及推广应用，并以此服务于公共健康和生命科学。我们尤其致力于研发国际领先的cfRNA检测相关技术及产品，目前已推出基于硅磁聚体（SMAGG）专利技术的微量small RNA分离纯化试剂盒和基于接头自连产物去除专利技术的微量small RNA文库构建试剂盒。新辉生物目前业务正处于快速发展阶段。在本次Distrimap招商会上，新辉生物希望能在全国携手志同道合的代理商朋友，让广大的中国科研工作者都能获得满足需求的small RNA提取及建库全流程解决方案。

       会议名称:生命科学新品(招商)推介会暨产业链展

       会议时间:2024年4月23日-24日

       会议地点:苏州香格里拉大酒店

       会议地址:苏州市新区塔园路168号